Notícies
19.10.2021Criomètodes per a Estudis de Microscòpia Òptica i Electrònica Correlativa (CLEM) sobre mostres amb ultraestructura altament preservada
La Unitat de Criomicroscòpia Electrònica dels CCiTUB, amb més de 15 anys d'experiència en criomètodes, ha adaptat els seus protocols de Crioimmobilització, Criosubstitució i inclusió en resines acríliques per tal que els usuaris puguin dur a terme estudis de Microscòpia Òptica i Electrònica Correlativa (Correlative Light and Electron Microscopy, CLEM). La crioimmobilització per High Pressure Freezing (HPF) consisteix en la fixació de la mostra mitjançant la combinació d'una pujada de la pressió (2.100 bars) simultàniament a una ultraràpida baixada de la temperatura (mínim 10.000 graus Celsius per segon), aconseguint passar l'aigua de la mostra directament a estat de gel vitri, evitant l'estat de gel cristal·lí i, per tant, mantenint la ultraestructura biològica en un estat molt proper a com es trobaria a la natura. A més a més, mitjançant els criomètodes les mostres es processen a baixes temperatures, limitant l'ús d'agents químics i minimitzant així els artefactes estructurals derivats dels mètodes convencionals.
Al llarg de l'última dècada la CLEM s'ha convertit en una tècnica àmpliament utilitzada per a explorar mostres biològiques i biomèdiques a escales diferents, ja que ambdos tipus de microscòpies ofereixen resolucions molt diferents, però alhora complementàries. Mentre que la Microscòpia Òptica pot aplicar-se directament per a l'adquisició d'imatges de mostres de cèl·lules i teixits in vivo, la Microscòpia Electrònica necessita mostres fixades prèviament, ja sigui per mètodes convencionals o per criomètodes. El principal avantatge dels criomètodes és que proporcionen un elevat grau de preservació dels tots els components cel·lulars, així com dels epítops diana dels anticossos i les proteïnes fluorescents, alhora que les resines acríliques permeten l'accés dels anticossos als seus epítops diana. D'aquesta manera es crea un context cel·lular òptim per a l'aplicació de tècniques de CLEM, tant de mostres que ja incorporen fluorescència prèviament com de mostres a les que se'ls hi ha d'afegir doble immunomarcatge: per a fluorescència (anticossos conjugats amb fluoròfors) i per a microscòpia electrònica (anticossos conjugats amb or col·loidal).
Un cop preparades les mostres per a CLEM, aquestes s'observen primer en el microscopi de fluorescència, on es seleccionen les àrees d'interès i es fotografien. Posteriorment, les mateixes mostres s'observen al microscopi electrònic de transmissió, on es cerquen les mateixes àrees fotografiades prèviament i se n'adquireixen imatges de la seva ultraestructura. Finalment, s'obtenen imatges de la mateixa zona a dues resolucions complementàries, que es poden superposar i així determinar amb detall la ultraestructura de les àrees fluorescents.
Als CCiTUB els usuaris poden dur a terme experiments de CLEM, obtenint les imatges de microscòpia de fluorescència a les Unitats de Microscòpia Òptica Avançada i, posteriorment, les imatges de microscòpia electrònica de transmissió a les Unitats de TEM-SEM i de Criomicroscòpia Electrònica. D'aquesta manera l'usuari pot obtenir un volum d'informació molt més elevat del que es disposaria fent servir únicament una de les tècniques.