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19.10.2021Criométodos para Estudios de Microscopia Óptica y Electrónica Correlativa (CLEM) sobre muestras con ultraestructura altamente preservada
La Unidad de Criomicroscopía Electrónica los CCiTUB, con más de 15 años de experiencia en criométodos, ha adaptado sus protocolos de Crioinmobilización, Criosustitución e inclusión en resinas acrílicas para que los usuarios puedan llevar a cabo estudios de Microscopía Óptica y Electrónica correlativa (Correlative Light and Electron Microscopy, CLEM). La crioinmobilización por High Pressure Freezing (HPF) consiste en la fijación de la muestra mediante la combinación de una subida de la presión (2.100 bares) simultáneamente a una ultrarrápida bajada de la temperatura (mínimo 10.000 grados Celsius por segundo), consiguiendo pasar agua de la muestra directamente en estado de gel vítreo, evitando el estado de hielo cristalino y, por tanto, manteniendo la ultraestructura biológica en un estado muy cercano a como se encontraría en la naturaleza. Además, mediante los criométodeo las muestras se procesan a bajas temperaturas, limitando el uso de agentes químicos y minimizando así los artefactos estructurales derivados de los métodos convencionales.
A lo largo de la última década la CLEM se ha convertido en una técnica ampliamente utilizada para explorar muestras biológicas y biomédicas a escalas diferentes, ya que ambos tipos de microscopias ofrecen resoluciones muy diferentes, pero a la vez complementarias. Mientras que la Microscopía Óptica puede aplicarse directamente para la adquisición de imágenes de muestras de células y tejidos in vivo, la Microscopia Electrónica necesita muestras fijadas previamente, ya sea por métodos convencionales o por criométodos. La principal ventaja de los criométodos es que proporcionan un elevado grado de preservación de los todos los componentes celulares, así como de los epítopos diana de los anticuerpos y las proteínas fluorescentes, al tiempo que las resinas acrílicas permiten el acceso de los anticuerpos a sus epítopos diana. De esta manera se crea un contexto celular óptimo para la aplicación de técnicas de CLEM, tanto de muestras que ya incorporan fluorescencia previamente como de muestras a las que se les ha de añadir doble inmunomarcaje: para fluorescencia (anticuerpos conjugados con fluoróforos) y para microscopía electrónica (anticuerpos conjugados con oro coloidal).
En las Unidades de Microscopía Óptica Avanzada de los CCiTUB los usuarios pueden llevar a cabo experimentos de CLEM, obteniendo las imágenes de microscopía de fluorescencia y, posteriormente, en las unidades de TEM-SEM y de Criomicroscopía Electrónica, las imágenes de microscopía electrónica de transmisión. De esta manera el usuario puede obtener un volumen de información mucho más elevado del que se dispondría utilizando únicamente una de las técnicas.