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Un objetivo fundamental de la biología estructural moderna es descifrar la organización celular para dilucidar la disposición espacial de los complejos macromoleculares dentro de una célula. Estudios tridimensionales combinados con métodos de crio-preparación para la microscopía electrónica permiten el estudio de muestras biológicas en un estado casi in vivo “hidratado” y “tridimensional”. Para llevar a cabo estos estudios, las muestras tienen que ser crio-inmovilizadas, ya sea por congelación por inmersión, congelación por impacto, congelación autopresurizada o por congelación a alta presión. Estos métodos vitrifican el agua de la muestra e inmovilizan el contenido de la célula casi de manera instantánea. El objetivo es la obtención de hielo “vítreo” o amorfo después de una congelación ultra-rápida, sin destruir las estructuras celulares y preservando el momento preciso de sus interacciones, las cuales cambian rápidamente in vivo. La vitrificación permite la resolución espacial y temporal de los procesos celulares.
Una vez se tienen las células inmovilizadas por congelación, se pueden aplicar dos estrategias para estudiar la tridimensionalidad de las estructuras de interés: el análisis de partícula individual y la crio-tomografía electrónica. Las partículas individuales son macromoléculas aisladas, agregados macromoleculares, pequeños orgánulos, pequeñas estructuras celulares o pequeños organismos que no necesitan ser cortados y el procedimiento que se lleva a cabo es la reconstrucción de las diferentes orientaciones de la partícula en una rejilla de microscopía electrónica.
La crio-tomografía electrónica se refiere a la reconstrucción tridimensional de las estructuras aisladas o de crio-secciones, adquiriendo imágenes a baja temperatura y en todas las direcciones posibles del haz de electrones. Esto se consigue mediante la inclinación del soporte de la rejilla que contiene la muestra y adquiriendo imágenes a intervalos regulares de inclinación. Recientemente, el uso de microscopios de doble haz de electrones e iones ha significado un gran avance para la preparación de muestras para la crio-tomografia de electrónica.
Por otro lado, la crio-sustitución, juntamente con otras técnicas como Tokuyasu y los nuevos métodos de rehidratación y métodos VIS2FIX, también se pueden combinar con el marcaje inmuno-oro sobre la sección para estudios de localización de proteínas consiguiendo además una buena morfología. En este seminario se prestará una atención especial a los métodos CLEM (Correlative Light and Electron Microscopy) y los primeros resultados para conseguir una etiqueta clonable para microscopía electrónica.
Fecha: 10/07/2013
Hora: 10:30h a 11:30h
Lugar: Aula de los CCiTUB. Edificio CCiTUB, 1ª planta. c/Lluís Solé i Sabarís, 1-3. Barcelona
Coste: Gratuito
Ponente:Carmen López, Tecnología de Crio-Microscopía electrònica de los CCiTUB
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